Bigger and Better Photons: The Road to Great FLIM?Results
原文鏈接 by Wolfgang Becker
翻譯 by 譚瓅
摘要：這篇文章試圖幫助bh FLIM技術(shù)的現(xiàn)有和未來(lái)用戶從FLIM實(shí)驗(yàn)中獲得最佳結(jié)果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理，并給出了記錄的光子分布的效果。它表明，測(cè)量壽命的信噪比在優(yōu)先取決于記錄的光子數(shù)量。第二部分重點(diǎn)介紹優(yōu)化光子數(shù)，而不增加施加到樣品中的光應(yīng)力。我們討論了激發(fā)功率、采集時(shí)間、采集效率、數(shù)值孔徑、聚焦精度、對(duì)準(zhǔn)精度和探測(cè)器效率的影響。第三部分將重點(diǎn)介紹光子效率。它考慮了TCSPC計(jì)時(shí)參數(shù)、計(jì)數(shù)背景、像素?cái)?shù)、儀器響應(yīng)函數(shù)的影響，以及多指數(shù)衰減函數(shù)的挑戰(zhàn)。最后一部分專門介紹數(shù)據(jù)分析。本文中的所有結(jié)論均通過在實(shí)際條件下記錄的真實(shí)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行演示。
優(yōu)質(zhì)的FLIM圖像
圖1：BPAE樣品的FLIM圖像，2048 x 2048像素，衰減函數(shù)記錄在256個(gè)時(shí)間通道中。采用bh DCS-120 共聚焦 FLIM 系統(tǒng)，bh SPCImage FLIM 數(shù)據(jù)分析軟件。
是什么造就了一個(gè)好的FLIM圖像？它應(yīng)該具有完美的空間分辨率、足夠高的像素?cái)?shù)、高對(duì)比度、低背景噪聲，沒有失焦模糊，并且它應(yīng)該以高信噪比顯示熒光壽命。如上圖所示。有經(jīng)驗(yàn)的FLIM用戶可能會(huì)補(bǔ)充說，僅僅記錄熒光壽命是不夠的，整個(gè)衰減函數(shù)應(yīng)該記錄在每個(gè)像素中。
為什么發(fā)表在科學(xué)論文中的FLIM圖像很少看起來(lái)像上面的圖像？這實(shí)際上沒有任何理由。所有要做的就是使用完美對(duì)準(zhǔn)的光學(xué)元件，正確的顯微物鏡，完美的聚焦，正確的激發(fā)和探測(cè)波長(zhǎng)，正確的探測(cè)器以及一點(diǎn)點(diǎn)耐心。對(duì)FLIM的信號(hào)處理原理的一些理解也可能有所幫助，這些是每個(gè)FLIM用戶都可以實(shí)現(xiàn)的。
本文介紹了獲得出色的 FLIM 結(jié)果的重要因素，給出的大多數(shù)建議都是微不足道的。然而，差之毫厘，失之千里，正是這些瑣碎事物的總和，使得完美的FLIM結(jié)果區(qū)別于平庸的FLIM結(jié)果。
第一部分：TCSPC FLIM結(jié)果是光子的分布
TCSPC FLIM原理
追求完美FLIM結(jié)果的道路始于理解TCSPC FLIM結(jié)果是光子的分布，參考文獻(xiàn)[1]。記錄過程的基本原理如圖2所示。
通過高頻脈沖激光束掃描樣品，探測(cè)器探測(cè)發(fā)射的熒光單光子，并由TCSPC系統(tǒng)測(cè)量激光脈沖周期內(nèi)每個(gè)光子的到達(dá)時(shí)間t。同時(shí)，TCSPC系統(tǒng)確定激光束在光子探測(cè)時(shí)刻的空間坐標(biāo)x，y。從這些數(shù)據(jù)中，光子在空間坐標(biāo)上和時(shí)間上的分布被建立起來(lái)。這種光子分布是期望的壽命圖像：它是x*y像素的數(shù)據(jù)陣列，每個(gè)像素都包含大量連續(xù)時(shí)間通道中的熒光衰減函數(shù)。參見圖 2右。記錄過程及其各種擴(kuò)展的詳細(xì)說明可以在文獻(xiàn)[2]中找到。
圖2：TCSPC FLIM原理
圖3給出了FLIM記錄的光子分布的效果。該圖顯示了 8 個(gè)水平 x 128 垂直像素的圖像區(qū)域。每個(gè)像素有256個(gè)時(shí)間通道，包含該像素的衰減數(shù)據(jù)。當(dāng)然，真實(shí)的FLIM圖像具有更高的像素?cái)?shù)。常規(guī)FLIM為采用256至1024個(gè)時(shí)間通道的512 x512像素的格式，并且已經(jīng)演示過采用256個(gè)時(shí)間通道的2048 x 2048像素的格式，參考文獻(xiàn)[2]。
對(duì)于沒有經(jīng)驗(yàn)的用戶來(lái)說，圖3中所示的分布可能看起來(lái)非常“嘈雜”：?jiǎn)蝹€(gè)像素中的熒光衰減幾乎看不見。當(dāng)然，這些“噪聲”不是由探測(cè)器或TCSPC電子設(shè)備的任何噪聲引起的，它只是一種光子統(tǒng)計(jì)的效應(yīng)，噪聲如此之高的原因是光子分布在大量的像素和時(shí)間通道上。因此，每個(gè)像素的光子數(shù)都很低，特別是在每個(gè)像素中各個(gè)時(shí)間通道中的光子數(shù)更低。那么，如何降低光子分布中的“噪聲”呢？唯一的方法是記錄更多的光子，見圖4。
圖3：TCSPC FLIM的光子分布。該圖表示 X × Y = 8 × 128 像素的圖像區(qū)域，每個(gè)像素有256個(gè)時(shí)間通道，每個(gè)時(shí)間通道都包含熒光衰減周期內(nèi)連續(xù)時(shí)間的光子。
圖4：與圖3所示的光子分布相同，但記錄的光子多10倍，信噪比高出3.1倍，單個(gè)像素中的熒光衰減曲線清晰突出。
信噪比——SNR
從這些數(shù)據(jù)中得出的熒光壽命的信噪比是多少？我們從一個(gè)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)中獲得答案。
根據(jù)定義，熒光壽命τ是分子保持在激發(fā)態(tài)的平均時(shí)間。當(dāng)一個(gè)分子發(fā)出一個(gè)光子時(shí)，這意味著它從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)。FLIM系統(tǒng)探測(cè)單個(gè)光子并測(cè)量它們相對(duì)于激發(fā)脈沖的時(shí)間t，如圖5 a和b。當(dāng)FLIM系統(tǒng)探測(cè)到大量這樣的光子時(shí)，它們?cè)诩ぐl(fā)脈沖后到達(dá)探測(cè)器的平均時(shí)間是分子處于激發(fā)態(tài)的平均時(shí)間，即為熒光壽命，見圖5 c。雖然FLIM硬件通常不直接計(jì)算平均到達(dá)時(shí)間，但它存在于光子分布中。
圖5，a和b：光子的探測(cè)和激發(fā)后一段時(shí)間（t）內(nèi)光子隨時(shí)間的分布. c：探測(cè)N光子后的光子分布，激發(fā)后的平均到達(dá)時(shí)間<t>是熒光壽命τ. d：到達(dá)時(shí)間（t）的標(biāo)準(zhǔn)差σt，是熒光壽命τ。平均到達(dá)時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)差 στ 為 τ /SQRT(N).
平均到達(dá)時(shí)間的信噪比是多少？單個(gè)光子到達(dá)時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)偏差στ與熒光壽命τ本身相同，這是指數(shù)函數(shù)的性質(zhì)。如果我們平均大量（ N 個(gè)）光子的到達(dá)時(shí)間，則結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差στ隨N的平方根而減小，請(qǐng)參見圖5，d。因此，探測(cè)到N個(gè)光子后的信噪比，即τ除以其標(biāo)準(zhǔn)偏差στ的比值為：
SNRτ = τ / στ = SQRT (N)
這意味著可以獲得熒光壽命的標(biāo)準(zhǔn)偏差只是衰減曲線中光子數(shù)量的平方根，參考文獻(xiàn)[17]，這在幾個(gè)方面是一個(gè)了不起的結(jié)果。首先，像素壽命的信噪比與像素強(qiáng)度的信噪比相同，這否定了FLIM比穩(wěn)態(tài)成像需要更多的光子（因此需要更多的采集時(shí)間）的普遍觀點(diǎn)。其次，信噪比僅取決于N，特別是，不依賴于記錄熒光衰減的時(shí)間通道數(shù)。換句話說，您可以增加時(shí)間通道的數(shù)量，以提高時(shí)間分辨率或減少采樣偽影，而不會(huì)影響信噪比。第三，由于SNR僅依賴于N，因此提高壽命精度的唯一方法是增加N。這意味著你要么必須減少像素的數(shù)量 – 你通常不希望 – 或者記錄更多的光子。記錄更多光子是獲得良好FLIM結(jié)果的關(guān)鍵，也是下一部分的主題。
光子分布的一階矩
如上所述，單指數(shù)衰減（或單指數(shù)衰減近似）的熒光壽命可以通過計(jì)算光子的平均到達(dá)時(shí)間來(lái)獲得。如果光子的單個(gè)到達(dá)時(shí)間不可用，則可以通過從完整的光子分布中計(jì)算“一階矩” M1 （參考文獻(xiàn)[18]）獲得平均到達(dá)時(shí)間：
上述等式中的時(shí)間t，是光子在FLIM系統(tǒng)的觀測(cè)時(shí)間間隔內(nèi)的時(shí)間，而不是從激發(fā)脈沖之后的時(shí)間。因此，必須減去激發(fā)時(shí)間（在實(shí)踐中是IRF的一階矩）才能得到熒光壽命τ：
τ = M1fluorescence ?M1IRF
該方法如圖2所示。藍(lán)點(diǎn)是各個(gè)時(shí)間通道中的光子數(shù)，綠色曲線是IRF，紅色曲線是通過用IRF卷積指數(shù)函數(shù)e-t/τ來(lái)計(jì)算的假設(shè)熒光衰減函數(shù)。
圖6：熒光壽命的一階矩計(jì)算，熒光壽命是熒光的一階矩和IRF的一階矩的差值。
一階矩技術(shù)以理想的信噪比提供單指數(shù)衰減的時(shí)間。但是，它不會(huì)提供多指數(shù)衰減函數(shù)的參數(shù)，并且如果記錄包含背景計(jì)數(shù)，或只有一部分衰減函數(shù)位于TCSPC系統(tǒng)的觀測(cè)時(shí)間間隔內(nèi)，則它不會(huì)提供正確的衰減時(shí)間。因此，它幾乎完全被曲線擬合技術(shù)所取代。然而，一階矩技術(shù)有其優(yōu)點(diǎn)：它可在非常低的光子數(shù)下可靠地工作，適用于在線FLIM應(yīng)用中的快速壽命測(cè)定，最重要的是，它提供了一種在理想和非理想條件下估計(jì)FLIM信噪比的方法。我們將在本文的后面部分使用到此方法。
SQRT（N）關(guān)系的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證如圖7所示。以不同的采集時(shí)間掃描染料溶液，以獲得每像素包含約200，1600和9000個(gè)光子的FLIM圖像。典型的衰減曲線如圖7的頂行所示。第二行顯示了單個(gè)像素中熒光壽命的直方圖，它是用一階矩分析獲得的，στ 值和σ/τ = SNR 值在直方圖中顯示。從這些值可以看出，σ/τ確實(shí)非常接近于SQRT（N）。圖 7 的底行顯示了通過 MLE（最大似然估計(jì)）擬合獲得的壽命直方圖。從MLE擬合獲得的壽命直方圖比從矩分析中獲得的直方圖要寬一些，而且MLE結(jié)果也接近SQRT（N）的理想信噪比。
圖 7：SQRT （N） 關(guān)系的驗(yàn)證。頂行：來(lái)自羅丹明110染料溶液的FLIM數(shù)據(jù)單個(gè)像素的衰減曲線。從左到右：N = 200個(gè)光子，N = 1600個(gè)光子，N = 9000個(gè)光子。第二行：通過一階矩方法分析獲得的壽命直方圖。底行：通過 MLE 分析獲得的壽命直方圖。
光子效率
探測(cè)到光子并不一定意味著它有效地有助于壽命測(cè)量的準(zhǔn)確性。它可能因TCSPC模塊中不適宜地選擇的計(jì)時(shí)參數(shù)而丟失，其探測(cè)時(shí)間可能因探測(cè)器傳輸時(shí)間的不確定性而受損，或者可能存在來(lái)自背景信號(hào)的光子給光子分布增加額外的噪聲。在所有這些情況下，獲得的壽命的SNR都小于理想值SQRT（N）。這種情況可以用“光子效率”E來(lái)描述。E的倒數(shù)表示與理想系統(tǒng)相比，非理想系統(tǒng)需要多少光子才能達(dá)到相同的信噪比。由于SNR與光子數(shù)的平方根成比例，光子效率也可以寫為
E = (SNRreal / SNRideal)2
光子效率E是“品質(zhì)因數(shù)”的平方，有時(shí)用于比較不同壽命測(cè)量技術(shù)的效率（參考文獻(xiàn)[10，16]）。正確配置的TCSPC系統(tǒng)在最佳條件下工作，其光子效率接近1，達(dá)到理想的光子效率將是“最大化光子效率”這一部分的主題。
References
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